扶正解毒散普通粉和超微粉均按三因素三水平的正交试验设计,共9组实验,每组实验3个重复,L9(34)正交表如表1所示。
1.2.3供试品溶液的制备
精密称取扶正解毒散普通粉和超微粉5 g若干份,在不同温度的水、不同水量、不同浸泡时间条件下进行浸泡,得到扶正解毒散水浸液。将水浸液过滤,取续滤液至少30 mL,其中25 mL置于已干燥至恒重的坩埚中,105 ℃下干燥2 h,再次称重,通过增重量计算水溶性浸出物的含量。
另取5 mL水浸液,加入适量95%乙醇使乙醇的含量为80%。充分混匀后冷藏过夜,6000 r/min离心5 min,上清液过0.22 μm微孔滤膜后即得淫羊藿苷供试液。弃去剩余上清液,分别用2 mL丙酮和2 mL 95%乙醇洗涤沉淀,沉淀干燥后加入10 mL水充分溶解得到多糖水溶液。
1.2.4 苯酚-硫酸法测总多糖含量 吸取0.2 mL多糖水溶液至25 mL玻璃试管中,用水补至2 mL,加入6%苯酚1 mL,置冷水中迅速加入浓硫酸5.0 mL,摇匀后于冷水中放置5 min,然后置沸水浴中加热15 min,再置冷水中放置5 min,最后于490 nm波长下测吸光度。
准确吸取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1 mL共5份,分别置于玻璃试管中,补水至2.0 mL,按上述苯酚-硫酸法处理。以2.0 mL水按同样显色操作为空白样,横坐标为多糖微克数,纵坐标为吸光度值,制得葡萄糖标准曲线。
1.2.5 高效液相色谱法检测淫羊藿苷含量
准确吸取20 μL淫羊藿苷供试液,注入高效液相色谱仪进行检测。检测波长270 nm,进样量20 μL,流动相为30%乙腈,柱温35 ℃。
分别吸取10 μg/mL淫羊藿苷对照品1、2、5、8、10 μL,注入高效液相色谱仪检测。以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.6 回收率及重复性实验
用6份已知多糖含量的水浸液添加一定量葡萄糖对照品溶液,按1.2.4法测定吸光度,计算6份添加样品的回收率。并将同一已知浓度的多糖提取液连续测吸光度6次,计算相对标准偏差,考察其重复性。
用6份已知淫羊藿苷含量的水浸液添加一定量淫羊藿苷对照品溶液,按1.2.5法测定淫羊藿苷含量,计算6份添加样品的回收率。并将同一已知浓度的淫羊藿苷提取液连续测进样6次,计算相对标准偏差,考察其重复性。
1.2.7 结果处理
spss统计学软件处理正交试验结果,得到影响因素的主次顺序及其最佳水平,并比较相同提取条件下普通粉与超微粉的有效成分溶出量。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
多糖标准曲线为y = 6.820 3x - 0.032 7,R2= 0.999,如图1所示。淫羊藿苷标准曲线为y = 771.7x - 0.920 6,R2 = 0.999 1,如图2所示。标准曲线线性均关系良好,符合含量检测要求。
2.2回收率与重复性实验
3 讨论
多糖添加样品的回收率均在94.6%~99.7%之间,平均回收率98.2%,相对标准偏差为1.09%,精确度良好。重复性实验的相对标准偏差为0.13%,重复性良好。
淫羊藿苷添加样品的回收率均在97.3%~101.7%之间,平均回收率99.3%,相对标准偏差为1.12%,精确度良好。重复性实验的相对标准偏差为0.08%,重复性良好。
2.3有效成分浸出结果
9组实验的有效成分浸出量和与普通粉相比超微粉有效成分浸出量的提高率见表2。用spss统计学软件的方差分析法处理实验结果,以各种有效成分溶出量为指标,比较单个影响因素下三个水平的均值,按均值大小对三个水平排序[6] 。同时,按每个因素三个水平间的显著性检验结果对影响因素的主次进行排序。另外,综合考虑三种有效成分的溶出量,对影响因素的水平及影响因素的主次顺序进行综合评价,结果见表3。可以看出,影响因素的主次顺序为A>B>C,即温度>水量>时间,最佳因素水平为A3B3C1,即温度100 ℃、水量1:50(5 g药材加水250 mL)、浸泡0.5 h为最佳浸泡条件。
兽医临床中,通常将粉散剂用温水浸泡后饮水使用,残渣混饲使用。为了与临床使用条件一致,本实验将各个温度的水浸泡后让其自然冷却,每隔半个小时搅拌一次,达到浸泡时间后及时过滤水浸液检测主要有效成分。
药材的浸泡时间根据性质而定,一般浸泡至不再吸水即可,对花、叶、茎等药材为主的中药可浸泡20 min~30 min,以根、果实、为主的药材可浸泡60 min。浸泡时间不易过长,这是由于药材中的有效成分会被酶解或破坏,比如黄芩的酶在冷水中可以酶解黄芩苷而生成黄芩素,使其有效成分下降而降低疗效[7]。本实验中,浸泡0.5 h得到的溶出量比浸泡1 h和1.5 h的溶出量稍多,但差异不显著(P<0.05)。为了方便临床使用,减少用药时间,推荐最佳浸泡时间为0.5 h。
淫羊藿的主要有效成分为淫羊藿总黄酮(包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷等),具有降血压、增强免疫力、抗肿瘤等作用[8]。黄芪的主要有效成分是黄芪多糖[9],另外中药中的许多有效成分都溶于水。因此本实验选择淫羊藿苷、总多糖和水溶性浸出物为指标对各种浸泡条件进行优化。相同浸泡条件下,扶正解毒散超微粉中淫羊藿苷的浸出量量比普通粉平均提高115%,总糖提高31%,水溶性浸出物提高了17%。可以看出,将扶正解毒散进行超微粉碎后,大部分细胞破裂,有效成分溶出增加,用药量可以减少30%~50%。黄一帆等[10]比较了普通粉碎和超微粉碎对黄连解毒汤中黄芩苷溶出量的影响,结果发现超微粉碎可以增加黄芩苷的溶出,在超声提取下超微粉中黄芩苷溶出量比细粉提高32.5%;而在开水冲搅下,超微粉中黄芩苷溶出量比细粉提高51.15%,与本实验中超微粉有效成分溶出量的提高率基本一致。因此,多数中药材制成超微粉体后,有效成分溶出量均有较大程度提高,超微粉药物在中兽医领域有着巨大应用潜力。